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美寶胃腸膠囊維持胚胎小白鼠小腸組織植塊存活及重新組合成粘膜組織

2001年-11月-17日 來源:美寶國(guó)際集團(tuán)
美寶集團(tuán)中心實(shí)驗(yàn)室 徐榮祥,王運(yùn)平,范然,王建虹,林海

[摘 要]:目的:通過體外檢測(cè)美寶胃腸膠囊(GIC)對(duì)胚胎小白鼠小腸器官型植塊生長(zhǎng)的作用以探索GIC修復(fù)粘膜損傷的機(jī)理。方法:體外培養(yǎng)胚胎小白鼠小腸器官型植塊,并將所有植塊分為兩組:實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。結(jié)果:實(shí)驗(yàn)組的小腸器官型植塊能很好地維持存活,并有大量的單個(gè)細(xì)胞、細(xì)胞克隆以及片狀粘膜組織塊長(zhǎng)出,生長(zhǎng)的時(shí)間長(zhǎng),生長(zhǎng)狀態(tài)好;而對(duì)照組的小腸器官型植塊均很快歸于死亡。二者差異極為顯著。結(jié)論:GIC能夠維持胚胎小白鼠小腸器官型植塊的存活,并能促進(jìn)細(xì)胞增殖,某種程度上維持組織的完整性,重新組合成粘膜組織,此結(jié)果可能與GIC激活上皮干細(xì)胞有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]:GIC;小腸植塊;生長(zhǎng)

 

GIC Could Maintain Survival and Promote Cell Growth of Organ-Type Explants of Intestine of Mouse Embryo Xu rong-xiang,Wang Yan-ping,Fan Ran,etc。

Central laboratory, MEBO Global Group 100053

[Abstract]: Objective: To research on the reparative mechanism of GIC on intestinal lesion through examining the effect of on the survival and cell growth of organ-type explants of intestinal tissue of mouse embryo. Methods: Cultured the organ-type explants of mouse intestinal tissue in vitro, all the explants were divided into two groups: test group and control group. Results: Explants could survive in test group. Single cells, cell clones and tissue pieces could grew out of the explants and grew long and well in test group. Conclusion: could maintain survival of intestinal explants and promote growth of cells from intestinal explants of mouse embryo and this process may be involved in the activation of epithelial stem cells.

[Key words]: GIC; intestinal explant ; growth

  大量臨床實(shí)踐顯示,GIC可能也是通過激活粘膜上皮干細(xì)胞、促進(jìn)組織細(xì)胞生長(zhǎng)的機(jī)理實(shí)現(xiàn)對(duì)損傷粘膜修復(fù)的,為了證明這一觀點(diǎn),我們特設(shè)計(jì)了本實(shí)驗(yàn)。

 

  一. 儀器、設(shè)備、材料、試劑及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

  培養(yǎng)箱(美國(guó)Forma)、冰箱(江蘇長(zhǎng)嶺)、倒置顯微鏡(重慶光學(xué)儀器廠)、超級(jí)恒溫水浴及恒溫電烤箱(重慶四達(dá))、超凈工作臺(tái)(北京半導(dǎo)體設(shè)備二廠)、顯微成像分析系統(tǒng)(上??迫穑?、微波爐(廣東Galanz)、微型計(jì)算機(jī)(北京沐澤)、光學(xué)顯微鏡(江蘇光學(xué)儀器廠)、各種型號(hào)注射器、12孔培養(yǎng)板(丹麥NUNC)、50ml離心管、Eppendorf離心管、微量加樣器(1000μl、200μl、20μl、10μl, 均為法國(guó)Gilson)、大小滴頭、玻璃培養(yǎng)皿(φ5cm、φ6cm)、0.22μm微孔濾膜、針頭濾器、顯微外科器械、各種眼科手術(shù)器械、有蓋三角燒瓶、有蓋小試管、針頭、GIC(美寶公司生產(chǎn))、MEM培養(yǎng)基(美國(guó)Hyclone)、胎牛血清(杭州三利)、青霉素和鏈霉素(華北制藥)等。

  實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:昆明種胚胎小白鼠

 

  二. 實(shí)驗(yàn)方法:

  1.取孕16日齡的昆明雌性小白鼠,頸椎脫臼法處死之,先置于75%乙醇中粗洗一遍(2分鐘),再置于75%乙醇中消毒5分鐘;

  2.用眼科剪以及止血鉗先剪開雌鼠的腹部皮膚,鈍性分離至兩側(cè),充分暴露腹壁肌肉,然后小心剪開腹壁全層,切勿傷及內(nèi)臟及小鼠胚胎;

  3.剪開子宮,從宮腔中取出胚胎鼠,置入無菌平皿中;

  4.用雙抗-冷PBS將胚胎鼠體表洗滌兩次,每次1分鐘;

  5.用顯微外科剪刀將胚胎鼠的腹壁剪開,再用顯微外科鑷子夾起鼠近胃端小腸(包括十二指腸和空腸),截取2cm左右;

  6.用雙抗-冷PBS將胚胎鼠小腸連續(xù)洗滌兩次,每次1分鐘;

  7.用顯微外科剪刀將腸管縱行切開,充分暴露粘膜面;

  8.用雙抗-冷PBS將胚胎鼠小腸連續(xù)洗滌兩次,每次1分鐘;

  9.將鼠小腸置于含雙抗(青、鏈)的MEM培養(yǎng)液中沖洗2次,每次1分鐘;

  10.將鼠小腸剪成極小的器官型植塊,大小約1mm×1mm;

  11.將植塊置于12孔培養(yǎng)板的培養(yǎng)孔中央,每孔5塊,間隔約2mm,布局合理,粘膜面向上,輕輕按壓每塊植塊,使其緊貼培養(yǎng)板的表面;

  12.沿著培養(yǎng)孔的邊緣,每孔中加入約0.5ml的完全MEM培養(yǎng)液,勿使培養(yǎng)液與植塊接觸;

  13.將培養(yǎng)板置于37,5%培養(yǎng)箱中預(yù)孵育1.5小時(shí);

  14.每孔加完全MEM培養(yǎng)液2ml,輕拿輕放,切勿使植塊飄起,實(shí)驗(yàn)組加GIC;

  15.實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組同步等量換液,每次去掉原液的1/2左右, 再加入相同量的新鮮MEM培養(yǎng)液;

  16.用倒置顯微鏡觀察植塊生長(zhǎng)情況,用顯微成像記錄分析系統(tǒng)記錄所觀察的結(jié)果,并用計(jì)算機(jī)保存圖像。

 

  三.實(shí)驗(yàn)結(jié)果

  細(xì)胞培養(yǎng)110天內(nèi)的報(bào)告結(jié)果:實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的腸組織植塊在培養(yǎng)之初,均能固定在培養(yǎng)孔中央,但隨著培養(yǎng)時(shí)間的推移,植塊逐漸脫離培養(yǎng)孔底部平面,游離飄浮于深層培養(yǎng)液中,懸浮的位置仍然靠近培養(yǎng)孔底部,但仍然集中于培養(yǎng)孔中央,少數(shù)位于周邊,植塊的大小和形狀幾乎沒有變化,但在培養(yǎng)的第10天左右,組織塊就開始變得膨松,然后逐漸裂解為很小的組織塊,并最終成為肉眼不易察覺的組織塊,這時(shí)在視野中發(fā)現(xiàn)了單個(gè)細(xì)胞以及細(xì)胞克隆。在培養(yǎng)的第20天,對(duì)照組中的細(xì)胞以及細(xì)胞克隆逐漸死亡,而實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞依舊生長(zhǎng)良好,單個(gè)細(xì)胞越來越多,在視野中到處可見,以位于中央部位的最多,細(xì)胞圓形,細(xì)胞核清晰。細(xì)胞呈典型活細(xì)胞狀態(tài)。越向外越少,邊緣幾乎沒有,細(xì)胞克隆數(shù)也逐漸增多。每個(gè)克隆所含有的細(xì)胞個(gè)數(shù)隨著時(shí)間的推移也越來越多。上述結(jié)果說明含15%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基無法提供給組織塊合適而充足的營(yíng)養(yǎng),而GIC作為高級(jí)細(xì)胞培養(yǎng)基能夠提供給細(xì)胞合理而充足的營(yíng)養(yǎng),保證了組織和細(xì)胞的活性。

  下面為培養(yǎng)過程中,實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的對(duì)比圖譜,可以深刻反映兩組的差別。

圖1 培養(yǎng)第24天。圖1A為對(duì)照組,圖1B為實(shí)驗(yàn)組。對(duì)照組中的小腸組織細(xì)胞或細(xì)胞克隆已經(jīng)死亡,實(shí)驗(yàn)組中顯示的是大量單個(gè)的小腸組織細(xì)胞,但其中沒有克隆。
圖1A
圖1B
圖2 培養(yǎng)第30天。圖2A為對(duì)照組,圖2B為實(shí)驗(yàn)組。對(duì)照組中為位于視野中央的大量小腸組織細(xì)胞或細(xì)胞克隆已經(jīng)死亡,實(shí)驗(yàn)組中顯示的是即將形成克隆的細(xì)胞。
圖2A
圖2B
圖3 培養(yǎng)第38天。圖3A為對(duì)照組,圖3B為實(shí)驗(yàn)組。對(duì)照組中的小腸組織細(xì)胞或細(xì)胞克隆已經(jīng)死亡,實(shí)驗(yàn)組中顯示的是一塊較為完整的小腸粘膜組織。

 

圖3A
圖3B
圖4 培養(yǎng)第42天。圖4A為對(duì)照組,圖4B為實(shí)驗(yàn)組。對(duì)照組中的小腸組織細(xì)胞或細(xì)胞克隆已經(jīng)死亡,實(shí)驗(yàn)組中顯示的是一塊小腸粘膜組織。

 

圖4A
圖4B

圖5 培養(yǎng)第50天。圖5A為對(duì)照組,圖5B為實(shí)驗(yàn)組。對(duì)照組中的小腸組織細(xì)胞或細(xì)胞克隆已經(jīng)死亡,實(shí)驗(yàn)組中顯示的是兩塊小腸粘膜組織。

 

圖5A
圖5B
圖6 培養(yǎng)第85天。圖6A為對(duì)照組,圖6B為實(shí)驗(yàn)組。對(duì)照組中的小腸組織細(xì)胞或細(xì)胞克隆已經(jīng)死亡,實(shí)驗(yàn)組中顯示的是一塊小腸粘膜組織。
圖6A
圖6B
圖7 培養(yǎng)第90天。圖7A為對(duì)照組,圖7B為實(shí)驗(yàn)組。對(duì)照組中的小腸組織細(xì)胞或細(xì)胞克隆已經(jīng)死亡,實(shí)驗(yàn)組中顯示的是大量的分散生長(zhǎng)的小腸組織細(xì)胞。

 

圖7A
圖7B
圖8 培養(yǎng)第97天。圖8A為對(duì)照組,圖8B為實(shí)驗(yàn)組。對(duì)照組中的小腸組織細(xì)胞或細(xì)胞克隆已經(jīng)死亡,實(shí)驗(yàn)組中顯示的是一塊由細(xì)胞連接起來的片狀結(jié)構(gòu)。
圖8A
圖8B
  四.討 論

  GIC可使離體腸粘膜細(xì)胞在培養(yǎng)液中重新連接組合成粘膜組織

  現(xiàn)在一般均采用Trowell法進(jìn)行體外小腸粘膜組織的器官型培養(yǎng),此法從人體或動(dòng)物經(jīng)口腔取材,取材部位為十二指腸遠(yuǎn)端和空腸近端,將取出的粘膜(不可能是純粹的粘膜組織,應(yīng)該還包括粘膜下層、肌層等等,這與我們的做法一致),將粘膜放在金屬網(wǎng)格上,然后粘膜連同網(wǎng)格一起置于多孔培養(yǎng)板中央的孔,其它孔中置入無菌生理鹽水浸泡過的無菌紗布以便保持濕度,蓋好,置入一個(gè)密閉容器中,通95%的氧氣和5%的,37培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。這是目前通用的方法。但此法有明顯的缺點(diǎn),即方法較為繁瑣,取材量有限,一般每次不能多于10塊活組織,多了容易引起胃腸道出血,取材量受到限制,我們現(xiàn)在采用的方法對(duì)其進(jìn)行了很大的簡(jiǎn)化,直接從新處死的胚胎動(dòng)物體內(nèi)獲得無菌小腸粘膜組織,取材過程極容易控制量,也容易控制部位,特別方便快捷。

  由于體外培養(yǎng)目前還沒有適宜的人工合成培養(yǎng)基,現(xiàn)有的報(bào)道體外培養(yǎng)的小腸粘膜組織維持存活時(shí)間較短,不管是用RPMI-1640培養(yǎng)基(附加葡萄糖、胰島素、谷氨酰胺和胎牛血清),還是用Trowell培養(yǎng)基(附加胎牛血清),細(xì)胞均最多存活24~48小時(shí),之后就會(huì)出現(xiàn)退化和死亡,一般很難超過48小時(shí),培養(yǎng)基中如果不加血清,時(shí)間更短,6~12小時(shí)會(huì)退化壞死,由于植塊存活時(shí)間短,給實(shí)驗(yàn)者提供的檢測(cè)時(shí)間也很短,使多項(xiàng)目檢測(cè)不可能,只能檢測(cè)那些用藥之后立即就出現(xiàn)的反應(yīng),長(zhǎng)期效應(yīng)無法觀察,使實(shí)驗(yàn)受到了很大限制。而在本實(shí)驗(yàn)中我們使用的含有GIC細(xì)胞高級(jí)培養(yǎng)基直接打破了現(xiàn)有培養(yǎng)基方面的限制,可以長(zhǎng)期培養(yǎng)離體腸粘膜組織,可以長(zhǎng)期在光鏡下直接觀察GIC對(duì)粘膜生長(zhǎng)的影響。

  本實(shí)驗(yàn)中,GIC對(duì)腸粘膜組織的細(xì)胞保護(hù)作用也得到了明顯體現(xiàn);對(duì)于培養(yǎng)過程中觀察到的片狀粘膜組織,之所以能存在很久時(shí)間,并且其內(nèi)的細(xì)胞生長(zhǎng)良好,是GIC對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的正常代謝產(chǎn)生了影響,細(xì)胞外基質(zhì)是維系細(xì)胞相互連接的基礎(chǔ)。

  為什么胃粘膜能夠在這種環(huán)境中長(zhǎng)期生長(zhǎng)呢?有兩個(gè)原因:一是GIC是營(yíng)養(yǎng)豐富的細(xì)胞培養(yǎng)基及良好的細(xì)胞保護(hù)劑,另一個(gè)是腸道粘膜組織中有粘膜上皮干細(xì)胞,GIC啟動(dòng)了干細(xì)胞,使干細(xì)胞得以較長(zhǎng)時(shí)間地生長(zhǎng)。

  對(duì)于第一個(gè)問題的解釋:

  GIC有效成分中含有的亞油酸是細(xì)胞必需的脂肪酸,是構(gòu)成細(xì)胞生物膜不可缺少的組分,是皮膚、粘膜及深層組織損傷后進(jìn)行修復(fù)的重要材料;有效成分中含有的多種氨基酸如蛋氨酸、半胱氨酸、精氨酸、亮氨酸以及多種脂類物質(zhì)、維生素、微量元素,為腸粘膜細(xì)胞的生長(zhǎng)提供了豐富的營(yíng)養(yǎng);有效成分還具有抗病原微生物作用,對(duì)多種細(xì)菌、病毒、真菌、原生物都有較強(qiáng)的抑制作用,同時(shí)具有抗炎作用;藥物中的有效成分還可以促進(jìn)細(xì)胞的能量代謝,蛋白質(zhì)及核酸合成和生物膜轉(zhuǎn)運(yùn)等功能;緩慢釋放,使細(xì)胞持續(xù)得到穩(wěn)定的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)。

  GIC的抗氧化作用表現(xiàn)為抗自由基、穩(wěn)定細(xì)胞膜。自由基是廣泛存在于各種化學(xué)反應(yīng)中的活潑基團(tuán),倘若其產(chǎn)生過量,從而引發(fā)所謂的自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng),則將導(dǎo)致細(xì)胞膜多不飽和脂肪酸的脂質(zhì)過氧化,所產(chǎn)生的大量脂質(zhì)過氧化物會(huì)損傷細(xì)胞膜及細(xì)胞內(nèi)的大分子蛋白質(zhì)與核酸,對(duì)細(xì)胞造成損傷。有效成分中維生素E的抗自由基功能是由于其自身結(jié)構(gòu)具有還原性,進(jìn)而捕捉自由基從而阻斷自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng),起到對(duì)機(jī)體的保護(hù)作用,而其自身則經(jīng)過維生素C和含硫氨基酸的再生而還原或轉(zhuǎn)變?yōu)轷惢衔?。大量維生素E的存在可使細(xì)胞處于流動(dòng)性高、通透性嚴(yán)密的狀態(tài)。這除了可保護(hù)膜上大量的多不飽和脂肪酸不被氧化外,還與其可以保護(hù)膜蛋白的活性結(jié)構(gòu)有關(guān)。

  對(duì)于第二個(gè)問題的解釋:

  腸道粘膜組織中有粘膜上皮干細(xì)胞,在合適條件下能夠長(zhǎng)期生長(zhǎng),GIC有能力啟動(dòng)干細(xì)胞使之活化。腸道粘膜的上皮組織來源于上皮干細(xì)胞(epithelial stem cell), 用-胸腺嘧啶脫氧核苷(-TdR)標(biāo)記放射自顯影法觀察瞬間標(biāo)記后的腸腺細(xì)胞發(fā)現(xiàn),上皮干細(xì)胞位于或靠近腸隱窩的部位。為了維持動(dòng)態(tài)平衡,這些干細(xì)胞不斷轉(zhuǎn)化為短暫繁殖細(xì)胞并向中段移動(dòng),最后要么分化為具有吸收功能的刷狀緣上皮細(xì)胞,要么分化為腸道內(nèi)分泌細(xì)胞。分化后的細(xì)胞最后死亡并且從腸絨毛上脫落下來并進(jìn)入腸腔,任何干細(xì)胞都具有生長(zhǎng)繁殖的能力,它們是一群分化較低的細(xì)胞,這是干細(xì)胞與分化細(xì)胞明顯的不同,體外培養(yǎng)中最容易增殖的正常細(xì)胞是干細(xì)胞,干細(xì)胞屬于未分化細(xì)胞,盡管脫離了體內(nèi)生長(zhǎng)的微環(huán)境,但仍然具有較強(qiáng)的增殖能力??梢詳嘌杂捎贕IC具有激活表皮干細(xì)胞的能力,對(duì)粘膜干細(xì)胞也應(yīng)該有相應(yīng)的激活能力。

  至于生長(zhǎng)的細(xì)胞的性質(zhì),我們認(rèn)為一定是粘膜細(xì)胞,主要原因有兩個(gè):一是因?yàn)樯掀じ杉?xì)胞在體外有較強(qiáng)的增殖功能,這已經(jīng)為許多研究結(jié)果所證實(shí),腸壁其它細(xì)胞均不具備這種能力,本實(shí)驗(yàn)所用的標(biāo)本中,除粘膜細(xì)胞外,數(shù)量最多的應(yīng)該是腸壁的平滑肌細(xì)胞,平滑肌細(xì)胞在體外可進(jìn)行有限的增殖,但不能長(zhǎng)期增殖。本實(shí)驗(yàn)完全可以排除平滑肌細(xì)胞生長(zhǎng)的可能性,因?yàn)榕囵B(yǎng)自始至終未曾發(fā)現(xiàn)形態(tài)呈條形或梭形、排列呈束狀的平滑肌細(xì)胞生長(zhǎng)。再次,目前還沒有發(fā)現(xiàn)平滑肌干細(xì)胞,這也是平滑肌在體外不易長(zhǎng)期生長(zhǎng)的重要原因。其它細(xì)胞如粘膜下層疏松結(jié)締組織中的動(dòng)脈、靜脈、淋巴管、神經(jīng)纖維和粘膜下神經(jīng)叢等組織的細(xì)胞能如此生長(zhǎng)的可能性極小。第二個(gè)原因是優(yōu)勢(shì)生長(zhǎng)的問題,當(dāng)某種細(xì)胞特別容易生長(zhǎng)的時(shí)候,其它細(xì)胞的生長(zhǎng)就會(huì)受到一定程度的抑制或者完全被抑制,本實(shí)驗(yàn)中腸粘膜細(xì)胞在生長(zhǎng)中占優(yōu)勢(shì)或絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。

 

參 考 文 獻(xiàn)

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