［摘要］ 目的：探索燒傷濕性醫(yī)療技術(shù)于淺Ⅲ度燒傷時脂肪層燒傷創(chuàng)面自然修復的機制。方法：應用細胞免疫化學方法生物素－抗生物素蛋白(biotin-avidin)DCS體系間接免疫熒光技術(shù)。以小鼠抗人角蛋白19的單克隆抗體檢測表皮再生干細胞。結(jié)果：燒傷后24h可見表皮再生干細胞出現(xiàn)。燒傷后4天表皮再生干細胞數(shù)量增多。

燒傷后7天和14天表皮再生干細胞數(shù)量最多。燒傷后21天和28天表皮再生干細胞減少。結(jié)論：燒傷濕性醫(yī)療技術(shù)對淺Ⅲ度燒傷殘余組織中的再生表皮干細胞具有促進其激活和增生的作用。

［關(guān)鍵詞］ 燒傷 濕性醫(yī)療技術(shù) 表皮干細胞 細胞免疫化學

燒傷濕性醫(yī)療技術(shù)是燒傷治療學上的具有創(chuàng)新性的治療學術(shù)體系。目前已成功并普及推廣的治療技術(shù)為燒傷濕潤暴露療法與濕潤燒傷膏。在臨床上成功地解決了燒傷創(chuàng)面的疼痛、創(chuàng)面感染、創(chuàng)面的進行性壞死、燒傷深Ⅱ度創(chuàng)面的瘢痕愈合等四大國際燒傷難題。最近又取得了在Ⅲ度燒傷創(chuàng)面脂肪組織上再生皮膚的成果。深Ⅱ度燒傷和淺Ⅲ度燒傷使損傷的皮膚不再存留表皮基底層的干細胞。因此，使脂肪層燒傷創(chuàng)面自然修復的表皮再生干細胞的來源確實是值得深入研究的。

材 料 與 方 法

1. 取材 以下2例患者受傷后立即采用燒傷濕性醫(yī)療技術(shù)治療。

第1例：6歲男孩，熱水燙傷，背部、雙下肢。燙傷面積達33%。深Ⅱ度燙傷。

第2例：24歲男性青年，火焰燒傷四肢。燒傷面積25%，深Ⅱ度、淺Ⅲ度燒傷。

以上2例于正常部位及傷后24h、4天、7天、14天、21天、28天患處取皮膚或組織，立即放入凍存管于液氮中保存。然后放入OCT冷凍劑復合物(Tissue-Tek OCT Compound)中包埋，于液氮中冷凍。恒冷箱冰凍切片，厚度10祄。

2. 生物素—抗生物素蛋白DCS體系間接免疫熒光染色 先將冰凍切片用10%的馬血清于4℃孵育20min，然后滴加1:20稀釋的小鼠抗人角蛋白19型單克隆抗體（第1抗體）4℃孵育過夜。切片在磷酸緩沖液中涮洗后加第2抗體，即7.5礸/ml生物素化的馬抗小鼠IgG抗體(Vector Laboratories Burlingame, CA, USA)，4℃孵育1h。涮洗后，加10礸/ml熒光素-抗生物素蛋白DCS(Vector Laboratories Burlingame, CA, USA)于4℃孵育1h。將切片涮洗干凈后，用含10%PBS和1%對苯基二胺(P-phenylenediamine)的甘油做介質(zhì)封片。對照染色切片，則不加第1抗體。標本在Olympus反射式熒光顯微鏡下觀察，并用ASA400 KODAK膠卷照相。

結(jié) 果

用特異的小鼠抗人角蛋白19型的單克隆抗體(McAb)對正常和燒傷皮膚免疫細胞化學觀察結(jié)果表明，兩例正常皮膚表皮再生干細胞數(shù)量較少，可見少量顯示熒光的表皮細胞再生干細胞（圖5-4-1），即角蛋白19型陽性細胞。燒傷后24h，熒光顯微鏡下，顯示熒光的表皮再生干細胞數(shù)量中等程度（圖5-4-2），燒傷后4天，在汗腺、毛細血管和毛囊周圍可見開始增多的潛在表皮干細胞（圖5-4-3）。

燒傷后7天（圖5-4-4）,燒傷后14天（圖5-4-5），在該兩時間點鏡下可見比燒傷后4天繼續(xù)增多的表皮再生干細胞。潛在的再生干細胞即含人角蛋白19型細胞的數(shù)量達到燒傷療程中的峰值（數(shù)量最多）。至燒傷后21天（圖5-4-6）和28天（圖5-4-7）兩時間點潛在再生干細胞數(shù)量又減至一定的水平。觀察中發(fā)現(xiàn)患者經(jīng)濕性燒傷醫(yī)療技術(shù)治療后，潛在再生干細胞的增生狀態(tài)有一定的變化規(guī)律。潛在再生干細胞可能是表皮再生的干細胞的來源，這些在熒光顯微鏡下顯示熒光的細胞是深Ⅱ度和淺Ⅲ度燒傷后還存在的潛在的表皮再生干細胞。這些細胞可使燒傷濕性醫(yī)療技術(shù)治療的深Ⅱ度燒傷無瘢痕愈合，淺Ⅲ度燒傷皮膚再生。

討 論

國際上對細胞周期的深入研究表明，細胞周期與生理性再生、創(chuàng)傷修復有密切的關(guān)系。有些細胞長期停滯于G0期或G1期，在一定條件下才出現(xiàn)增生活動。有些細胞可持續(xù)進行分裂活動，分裂后的部分子細胞分化為執(zhí)行一定功能的成熟細胞，部分子細胞則一直保持連續(xù)增生能力，稱干細胞。皮膚表皮基底層干細胞可不斷進行分裂，新生的細胞向上方移動，在到達棘層深部時可再分裂二或三次，然后失去細胞分裂能力。

深Ⅱ度和淺Ⅲ度燒傷損傷了皮膚表皮和真皮深層，表皮基底層的干細胞全部受到破壞。殘存于皮下組織的毛囊、汗腺，以及毛細血管周圍的間充質(zhì)細胞都有可能提供表皮再生的干細胞。由于這些再生干細胞能合成特有的細胞角蛋白(19型)，所以可采用免疫細胞化學方法辨認這些細胞。我們的研究采用了抗人角蛋白19型單克隆抗體，應用生物素－抗生物素蛋白DCS體系間接免疫熒光技術(shù)，能夠準確、特異地檢測出深Ⅱ度和淺Ⅲ度燒傷后殘存于皮下組織的表皮再生干細胞。經(jīng)過燒傷濕性醫(yī)療技術(shù)治療后，于燒傷后7天至14天階段，潛在的再生干細胞即顯示人角蛋白19型免疫組織化學標志物的細胞數(shù)量達到峰值。這些顯示間接免疫熒光的細胞就是供脂肪層燒傷創(chuàng)面自然修復的表皮再生干細胞。由于燒傷濕潤暴露療法與濕潤燒傷膏的治療作用，可能激活了休眠狀態(tài)的潛在的表皮再生干細胞的增生。這有力地保證了深Ⅱ度或淺Ⅲ度燒傷，經(jīng)燒傷濕性醫(yī)療技術(shù)治療后，達到燒傷創(chuàng)面自然修復、無瘢痕愈合的療效。該技術(shù)解除了燒傷患者的瘢痕伴隨終生的痛苦。

表皮再生干細胞在移動和進行細胞分裂后，發(fā)生合成其他類型角蛋白(9型和16型）的細胞，這些細胞仍有移動能力。然后，它們分裂增生成的細胞合成較硬的角蛋白(1型和10型），這是成熟的表皮細胞所含的典型角蛋白。由此體現(xiàn)了燒傷濕性醫(yī)療技術(shù)對表皮再生干細胞具有促進其激活和增生的作用。

研究表明細胞從靜止期釋放出來，首先被激活的周期蛋白就是cyclin D，只有受到生長因子刺激后，它才表達。真核細胞生物在細胞的G1期決定進入增生狀態(tài)還是退出周期。G1期限制點的主要調(diào)控者是cyclin D1/CDK4復合體。為了深入研究燒傷濕性醫(yī)療技術(shù)療效作用機制，我們將進一步探索表皮再生干細胞細胞周期的基因調(diào)控。

圖5-4-1 正常皮膚、未見角蛋白19型陽性細胞  ×200

圖5-4-2 經(jīng)MEBT/MEBO治療燒傷后 24h，可見中等程度蛋白19型陽性細胞   ×200

圖5-4-3經(jīng)MEBT/MEBO治療燒傷后4天，角蛋白19型陽性細胞增多  ×200

圖5-4-4 經(jīng)MEBT/MEBO治療，燒傷后7天，角蛋白19型陽性細胞數(shù)量達峰值  ×200

圖5-4-5 經(jīng)MEBT/MEBO治療，燒傷后14天，角質(zhì)蛋白19型陽性細胞數(shù)量達峰值  ×200

圖5-4-6 經(jīng)MEBT/MEBO治療，燒傷后21天，角蛋白19型陽性細胞減少  ×200

圖5-4-7 經(jīng)MEBT/MEBO治療，燒傷后28天，角蛋白19型陽性細胞減少  ×200

圖5-4-1圖5-4-7均為應用小鼠抗人角蛋白19型單克隆抗體于冰凍切片染色(生物素－抗生物素蛋白DSC體系間接免疫熒光)照片。

(徐榮祥， 許增祿)